引言

靶细胞系瞬转被用于研究基因表达、蛋白质功能、治疗靶点的表达、细胞功能激活以及各种生物过程。在实验设计的初始阶段，摸索DNA浓度和转染试剂的范围是确定适当转染条件的重要一步。使用自动化工作站能够为整个过程提供准确性和重现性。

本实验中，以HEK293为例，采用Lipofectamine™ 3000的瞬转流程，我们使用Biomek i3桌面级自动化完成细胞铺板、转染配方准备、时间响应加样、混匀与后续成像/流式评估。该实验通过自动化操作结合Cytoflex流式细胞分析等，快速获得转染DOE实验数据，为后续降本与工艺窗口提供依据。

实验挑战

实验变量多：铺板密度、DNA负载、转染试剂体积、孵育时长、加样位置/速度、混匀方式等，手工难以保持跨板一致。

时序难统一：DNA+P3000与Lipo的孵育/混合到加样的时间差，将影响表达水平。

实验步骤

细胞铺板：HEK293，96孔平底黑壁透底板；铺板密度25,000/50,000 cells/100 μL，按列分布以便条件对比；铺板后用i3X MiniMax成像确认沉降与状态。

转染体系：依据试剂说明，比较DNA 100 vs 400 ng/孔；Lipo 0.15 vs 0.3 μL/孔；P3000比例按说明书添加；Opti-MEM为稀释体系。

图1：Biomek i3 DOE板布局

关键时序：对每种预混体系自动错开启动，使“混合→有效载荷加样”的孵育，统一为12分钟；有效载荷液面下约1 mm加样；缓慢吹吸+倾斜混匀。

培养与检测：转染后37°C，5% CO₂培养；用EVOS（明场+GFP）保持一致参数成像；再以CytoFLEX流式细胞分析仪进行定量。

图2：Biomek i3方法选项选择器MOS，支持轻松访问最常用的DOE方法设置

实验结果展示

图3：在每孔细胞接种密度为25000个细胞的四种预混体系条件下的典型荧光显微成像

图4：代表性的流式细胞术门控策略，从左上角顺时针：选择细胞、选择单线态细胞、将荧光门应用于阴性对照（仅限培养基）孔和将荧光门用于转染细胞孔

实验结论

本实验中，我们测试了Biomek i3自动化工作站开展脂质体瞬转DOE实验的可靠性。

1过高DNA浓度可能导致细胞毒性。检测数据结果支持这一假设，在400ng条件下，无论是在定性荧光成像分析还是定量流式细胞术数据中，转染效率都有所降低。

2在考虑Lipofectamine的剂量时，我们没有观察到0.15 μL和0.3 μL在下游转染效率方面存在显著差异，但50000个细胞接种密度和高DNA浓度加入的情况除外。未来的实验可能考虑降低Lipofectamine浓度来减少昂贵试剂的消耗，并通过在25000个细胞密度下接种来减少总细胞需求。

Biomek i3助力细胞转染DOE

• 桌面级体量，足够灵活：占地小，放在台面一角即可开工。

• 自动化动作更“友好”：缓慢吹吸+混匀，减少对细胞的机械刺激；液面下定点加样，减少气泡与扰动。

• 方法与数据都可复用：MOS快速复刻方法，CSV统一导入；成像/流式数据可横向比较。

• 面向未来的扩展：与培养箱、加热/振荡模块、HEPA/UV、外部检测设备形成“轻自动化集成生态”，从单次实验升级为稳定实验产出和生产力提升。

参考文献

应用说明《使用Biomek i3自动化工作站进行自动化细胞铺板和基于脂质体的瞬时转染实验设计（DOE）》